ಎಲಿಸಾ ಅವರಿಂದ ಬಣ್ಣಮಾಪನ ಮತ್ತು ವರ್ಣಮಾಪನದ ವಿಧಾನ

(1) ಬಣ್ಣದ ರೆಂಡರಿಂಗ್

ಕ್ರೋಮೋಜೆನಿಕ್ ELISA ಕಾವು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಕೊನೆಯ ಹಂತವಾಗಿದೆ, ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕಿಣ್ವವು ಬಣ್ಣದ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಬಣ್ಣರಹಿತ ತಲಾಧಾರವನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು ಸಮಯವು ಇನ್ನೂ ಬಣ್ಣದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವ ಅಂಶಗಳಾಗಿವೆ. ಒಂದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅವಧಿಯಲ್ಲಿ, ಋಣಾತ್ಮಕ ರಂಧ್ರವು ಬಣ್ಣರಹಿತವಾಗಿ ಉಳಿಯಬಹುದು, ಮತ್ತು ಧನಾತ್ಮಕ ರಂಧ್ರವು ಸಮಯದ ವಿಸ್ತರಣೆ ಮತ್ತು ಬಣ್ಣ ವರ್ಧನೆಯೊಂದಿಗೆ ಇರುತ್ತದೆ. ತಾಪಮಾನದ ಸೂಕ್ತ ಹೆಚ್ಚಳವು ಬಣ್ಣದ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ವೇಗಗೊಳಿಸಲು ಸಹಾಯಕವಾಗಿದೆ. ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ನಿರ್ಣಯದಲ್ಲಿ, ತಲಾಧಾರವನ್ನು ಸೇರಿಸಿದ ನಂತರ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು ಸಮಯವು ನಿಯಮಗಳ ಪ್ರಕಾರ ನಿಖರವಾಗಿರಬೇಕು. ಗುಣಾತ್ಮಕವಾಗಿ ನಿರ್ಧರಿಸಿದ ಬಣ್ಣವನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ನಡೆಸಬಹುದು, ಸಮಯವನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲ, ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ ಧನಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣ ಚೆನ್ನಾಗಿ ಮತ್ತು ನಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣದ ಪ್ರಕಾರ ಬಣ್ಣ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಯು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಸಮಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಅಥವಾ ವಿಸ್ತರಿಸಲು ಸೂಕ್ತವಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಸಮಯೋಚಿತ ತೀರ್ಪು.

ಹೊರಾಂಗಣ ತಾಪಮಾನ ಅಥವಾ 37 ಡಿಗ್ರಿಯಲ್ಲಿ 20-30 ನಿಮಿಷಗಳ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ನಂತರ OPD ತಲಾಧಾರದ ಬಣ್ಣ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಆಳವಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ನಂತರ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಸಮಯವನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸಬಹುದು. OPD ತಲಾಧಾರದ ದ್ರವವು ಬೆಳಕಿಗೆ ಒಡ್ಡಿಕೊಂಡಾಗ ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತವಾಗಿ ಬಣ್ಣವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತದೆ. ಬಣ್ಣದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ನಡೆಸಬೇಕು. ಬಣ್ಣ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ಮುಗಿದ ನಂತರ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಕೊನೆಗೊಳಿಸಲು ಮುಕ್ತಾಯದ ಪರಿಹಾರವನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. OPD ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಸಲ್ಫ್ಯೂರಿಕ್ ಆಮ್ಲದೊಂದಿಗೆ ಕೊನೆಗೊಳಿಸಿದ ನಂತರ, ಬಣ್ಣವು ಕಿತ್ತಳೆ ಹಳದಿಯಿಂದ ಕಂದು ಹಳದಿಗೆ ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ.

TMB ಬೆಳಕಿನಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಸೈಡ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ ಮೂಲಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ವೀಕ್ಷಿಸಲು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಆಪರೇಟಿಂಗ್ ಟೇಬಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಬಹುದು. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ಸರಿಯಾದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಓದಲು ಸಲಹೆ ನೀಡಲಾಗುತ್ತದೆ. HRP ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ, TMB ಯ ಬಣ್ಣವು ಸುಮಾರು 40 ನಿಮಿಷಗಳನ್ನು ತಲುಪಿತು, ನಂತರ ಕ್ರಮೇಣ ದುರ್ಬಲಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 2 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ಬಣ್ಣರಹಿತವಾಗಿ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಮರೆಯಾಯಿತು. TMB ವಿವಿಧ ಪರಿಹಾರಗಳಲ್ಲಿ ಕೊನೆಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ಸೋಡಿಯಂ ಅಜೈಡ್ ಮತ್ತು ಸೋಡಿಯಂ ಡೋಡೆಸಿಲ್ ಸಲ್ಫೇಟ್ (SDS) ನಂತಹ ಕಿಣ್ವ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಕೊನೆಗೊಳಿಸಬಹುದು. ಈ ರೀತಿಯ ಟರ್ಮಿನೇಟರ್ ನೀಲಿ ಬಣ್ಣವನ್ನು ದೀರ್ಘಕಾಲದವರೆಗೆ (12-24 ಗಂಟೆಗಳ) ನಿರ್ವಹಿಸುವಂತೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಇದು ದೃಷ್ಟಿಗೋಚರ ನಿರ್ಣಯಕ್ಕೆ ಉತ್ತಮ ಟರ್ಮಿನೇಟರ್ ಆಗಿದೆ. ಜೊತೆಗೆ, ವಿವಿಧ ಆಮ್ಲೀಯ ಟರ್ಮಿನೇಟರ್‌ಗಳು ನೀಲಿ ಬಣ್ಣವನ್ನು ಹಳದಿ ಬಣ್ಣಕ್ಕೆ ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತವೆ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ತರಂಗಾಂತರವನ್ನು (450nm) ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಓದಲು ಬಳಸಬಹುದು.

(2) ವರ್ಣಮಾಪಕ

ಕಲರ್ಮೆಟ್ರಿಯ ಮೊದಲು, ಪ್ಲೇಟ್ನ ಕೆಳಭಾಗದಲ್ಲಿ ಲಗತ್ತಿಸಲಾದ ದ್ರವವನ್ನು ಒಣಗಿಸಲು ಶುದ್ಧ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಕಾಗದವನ್ನು ಬಳಸಬೇಕು ಮತ್ತು ನಂತರ ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಕಿಣ್ವದ ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಕಲರ್ಮೀಟರ್ನ ವರ್ಣಮಾಪನ ಚೌಕಟ್ಟಿನಲ್ಲಿ ಸರಿಯಾಗಿ ಇರಿಸಬೇಕು. ಮೃದುವಾದ ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ವಾಹಕವಾಗಿ ಹೊಂದಿರುವ ಪರೀಕ್ಷೆಯಲ್ಲಿ, ಬಣ್ಣದ ಹೋಲಿಕೆಯನ್ನು ಕೈಗೊಳ್ಳುವ ಮೊದಲು ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ 96-ಹೋಲ್ ಫ್ರೇಮ್ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಬೇಕು. ಬಣ್ಣಕ್ಕಾಗಿ ತಲಾಧಾರದ ಪರಿಹಾರವನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೊದಲು, ಮೃದುವಾದ ಪ್ಲೇಟ್ನ ಅಂಚನ್ನು ಸ್ವಚ್ಛಗೊಳಿಸಿ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಸೀಟ್ ಫ್ರೇಮ್ನಲ್ಲಿ ಕುಳಿತುಕೊಳ್ಳಬಹುದು.

ವರ್ಣಮಾಪನ ಮಾಡುವಾಗ, ಶೂನ್ಯ ಬಿಂದುವನ್ನು ಮೊದಲು ಬಟ್ಟಿ ಇಳಿಸಿದ ನೀರಿನಿಂದ ಸರಿಹೊಂದಿಸಬೇಕು ಮತ್ತು ತಲಾಧಾರದ ರಂಧ್ರ (ಯಾವುದೇ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಿಲ್ಲದೆ ತಲಾಧಾರದ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ರಂಧ್ರ) ಮತ್ತು ಖಾಲಿ ರಂಧ್ರವನ್ನು (ಇಡೀ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಂತೆ ಮಾದರಿಯ ಬದಲಿಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯ ಲವಣಯುಕ್ತ ಅಥವಾ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವ ರಂಧ್ರ) ಅಳೆಯಬೇಕು ಮತ್ತು ಈ ಪರೀಕ್ಷೆಯ ಕಾರಕ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ದಾಖಲಿಸಲು ಓದಬೇಕು. ನಂತರ ಶೂನ್ಯ ಬಿಂದುವನ್ನು ಬಟ್ಟಿ ಇಳಿಸಿದ ನೀರಿನಿಂದ ಮಾಪನಾಂಕ ಮಾಡಲು ಖಾಲಿ ರಂಧ್ರಗಳನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು, ಮತ್ತು ಮೇಲಿನ ರಂಧ್ರಗಳ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಖಾಲಿ ರಂಧ್ರಗಳ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯಿಂದ ಕಳೆಯಬೇಕು ಮತ್ತು ನಂತರ ಲೆಕ್ಕ ಹಾಕಬೇಕು.

ವರ್ಣಮಾಪನದ ಫಲಿತಾಂಶದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಹಿಂದೆ ಆಪ್ಲಿಕಲ್ ಡೆನ್ಸಿಟಿ (OD) ಆಗಿದೆ, ಆದರೆ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆ (A) ಅನ್ನು ನಿಯಮಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಅದು ಒಂದೇ ಅರ್ಥವನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ. ಸಾಮಾನ್ಯ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ವಿಧಾನವೆಂದರೆ A ಅಕ್ಷರದ ಕೆಳಗಿನ ಬಲ ಮೂಲೆಯಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ತರಂಗಾಂತರವನ್ನು ಬರೆಯುವುದು. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, OPD ಯ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ತರಂಗಾಂತರವು 492nm ಆಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ವಿಧಾನವು "A492nm" ಅಥವಾ "OD492nm" ಆಗಿದೆ.

(3) ಕಿಣ್ವ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವರ್ಣಮಾಪಕ

ಕಿಣ್ವದ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವರ್ಣಮಾಪಕವನ್ನು ಕಿಣ್ವದ ಪ್ರಮಾಣಿತ ಉಪಕರಣ ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ, ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ELISA ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯುವ ಫೋಟೋಮೀಟರ್ ಅನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಘನ ವಾಹಕದ ವಿವಿಧ ರೂಪಗಳ ಪ್ರಕಾರ, ಪ್ಲೇಟ್, ಮಣಿ ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ ಪರೀಕ್ಷಾ ಟ್ಯೂಬ್ಗೆ ವಿಶೇಷ ವಿನ್ಯಾಸಗಳಿವೆ. ಅನೇಕ ಕಾರಕ ಕಂಪನಿಗಳು ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ಕಿಣ್ವ ಲೇಬಲ್ ಉಪಕರಣವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತವೆ. ಕಿಣ್ವ ಪ್ಲೇಟ್ ಉಪಕರಣದ ಮುಖ್ಯ ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆ ಸೂಚ್ಯಂಕಗಳು: ಓದುವ ವೇಗ, ಓದುವ ನಿಖರತೆ, ಪುನರಾವರ್ತನೆ, ಪದವಿ ಮತ್ತು ಅಳೆಯಬಹುದಾದ ಶ್ರೇಣಿ, ರೇಖೀಯತೆ ಮತ್ತು ಹೀಗೆ. ಉತ್ತಮ ಮೈಕ್ರೊಪ್ಲೇಟ್ ಮೀಟರ್‌ನ ಓದುವಿಕೆ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ 0.001 ಆಗಿರುತ್ತದೆ, ನಿಖರತೆ ± 1% ಮತ್ತು ಪುನರಾವರ್ತನೆಯು 0.5% ವರೆಗೆ ಇರುತ್ತದೆ. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, A ರಂಧ್ರದ A ಮೌಲ್ಯವು 1.083 ಆಗಿದ್ದರೆ, ಗಾಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ರಂಧ್ರದ ನಿಜವಾದ A ಮೌಲ್ಯವು 1.083±0.01 (1.073~1.093) ಆಗಿರಬೇಕು. ಹಲವಾರು ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಮಾಪನ, A ಮೌಲ್ಯವು 1.083±0.05 (1.078~1.088) ಆಗಿರಬೇಕು. ಎಂಜೈಮ್ ಪ್ಲೇಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಕದ ಅಳತೆಯ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯು ಕಿಣ್ವ ಪ್ಲೇಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಕದ ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ. ಸಾಮಾನ್ಯ ಕಿಣ್ವ ಪ್ಲೇಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಕದ ಮಿತಿಯು 0.000~2.000 ಆಗಿದೆ, ಆದರೆ ಹೊಸ ಕಿಣ್ವದ ಪ್ಲೇಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಕದ ಮಿತಿಯನ್ನು 2.900 ಅಥವಾ ಅದಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನದಕ್ಕೆ ವಿಸ್ತರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮಾಪನದ ಮೇಲಿನ ಮಿತಿಯನ್ನು ಮೀರಿದ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ "*" ಅಥವಾ "ಓವರ್" ಅಥವಾ ಇತರ ಚಿಹ್ನೆಗಳಿಂದ ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಅಳೆಯಬಹುದಾದ ಶ್ರೇಣಿ ಮತ್ತು ರೇಖೀಯ ಶ್ರೇಣಿಯ ನಡುವಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಕ್ಕೆ ಗಮನ ನೀಡಬೇಕು. ರೇಖೀಯ ಶ್ರೇಣಿಯು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಅಳೆಯಬಹುದಾದ ಶ್ರೇಣಿಗಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿರುತ್ತದೆ. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಒಂದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಕಿಣ್ವ ಪ್ಲೇಟ್ ಉಪಕರಣದ ಅಳೆಯಬಹುದಾದ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯು 0.000 ~ 2.900 ಆಗಿದೆ, ಆದರೆ ಅದರ ರೇಖೀಯ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯು ಕೇವಲ 0.000 ~ 2.000 ಆಗಿದೆ, ಇದು ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ELISA ನಲ್ಲಿ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಯನ್ನು ಮಾಡುವಾಗ ಗಮನ ಹರಿಸಬೇಕು.

ಕಿಣ್ವ ಲೇಬಲ್ ಉಪಕರಣವನ್ನು ಸೂರ್ಯನ ಬೆಳಕು ಅಥವಾ ಬಲವಾದ ಬೆಳಕಿನ ವಿಕಿರಣದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಇರಿಸಬಾರದು. ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣತೆಯು 15-30 ಡಿಗ್ರಿಗಳಾಗಿರಬೇಕು. ಉಪಕರಣವನ್ನು ಬಳಸುವ ಮೊದಲು 15 ರಿಂದ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಪೂರ್ವಭಾವಿಯಾಗಿ ಕಾಯಿಸಬೇಕು, ಆದ್ದರಿಂದ ಓದುವ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಹೆಚ್ಚು ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತವೆ.

A ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಅಳೆಯುವಾಗ, ಉತ್ಪನ್ನದ ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಗರಿಷ್ಠವನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಬೇಕು. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, OPD 492nm ತರಂಗಾಂತರವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ. ಮೊದಲ ಬಾರಿಗೆ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ತರಂಗಾಂತರ (W1) ಮತ್ತು ಎರಡನೇ ಬಾರಿ ಸೂಕ್ಷ್ಮವಲ್ಲದ ತರಂಗಾಂತರ (W2) ನಲ್ಲಿದೆ. ELISA ಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಸ್ಥಾನವು ಎರಡು ಅಳತೆಗಳ ನಡುವೆ ಚಲಿಸುವುದಿಲ್ಲ. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, OPD 492nm ಅನ್ನು W1 ಆಗಿ ಮತ್ತು 630nm ಅನ್ನು W2 ಆಗಿ ಬಳಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅಂತಿಮ ಅಳತೆಯ A ಮೌಲ್ಯವು ಎರಡರ ನಡುವಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸವಾಗಿದೆ (W1-W2). ಡ್ಯುಯಲ್ ತರಂಗಾಂತರದ ಓದುವಿಕೆ ಕಂಟೇನರ್‌ನಲ್ಲಿ ಗೀರುಗಳು ಅಥವಾ ಬೆರಳಿನ ಗುರುತುಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಬೆಳಕಿನ ಅಡಚಣೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.